НИИ физико-химической биологии

Научная работа

Научная тематика института традиционно входит в программы, разрабатываемые по постановлениям правительства страны. В 2002 г. научно-исследовательская работа сотрудников института осуществлялась в рамках следующих научных направлений:

– Биология клетки и клеточных органелл.

– Биоэнергетика. Фотосинтез.

– Математические модели в биологии.

– Молекулярная вирусология.

– Структура, экспрессия и эволюция генома.

– Энзимология и биотехнология.

В 2002 г. 120 научных проектов ученых института были поддержаны РФФИ, 2 проекта – фондом «Университеты России», 12 проектов – фондом Миннауки РФ. В 2002 г. ученые института участвовали в разработке 28 международных проектов.

К основным научным достижениям 2002 г. относятся следующие.

В отделе биохимии вирусов растений :

1. Продолжена работа по изучению особенностей трансляции РНК вирусов растений. Показано, что при трансляции комплекса транспортного белка ТБ-1 Х-вируса картофеля с вирусом не используется механизм трансляционной разборки; а быстрая и, вероятно, кооперативная разборка белка оболочки комплекса ТБ-1 – ХВК индуцируется на начальных стадиях элонгации трансляции РНК ХВК. Показано, что активность участков внутренней посадки рибосом вирусных РНК (УВПР или IRES) связана с наличием в них поли(А)-богатых полипуриновых последовательностей, а для одного из них – (IRESCP,148CR) показано, что он содержит последовательности Шайна–Дальгарно. Созданы активные искусственные УВПР, обеспечивающие кэп-независимую экспрессию 3'-проксимальных цистронов, составляющую более 25–30% от кэп-зависимой экспрессии моноцистронного транскрипта.

2. Продолжена работа по изучению транспорта ВТМ и ХВК по растению. В рамках работ по выявлению возможных клеточных рецепторов транспортного белка ВТМ показано, что обнаруженный ранее потенциальный рецептор ТБ ВТМ (транспортного белка вируса табачной мозаики) – пектилметилэестераза (ПМЭ) оказывает негативный эффект на транспорт ВТМ.

В рамках изучения свойств транспортных белков вирусов показано, что замена в транспортном белке ВТМ треонина в положении 104 на аминокислоту, несущую отрицательный заряд, приводит к подавлению транспортных функций белка, а необходимый для транспорта инфекции белок оболочки ХВК обладает значительной АТФазной активностью.

Разработаны векторы для высокоэффективной экспрессии вирусных белков в растении на основе генома вируса табачной мозаики (ВТМ) и на основе крВТМ, обеспечивающие высокий уровень экспрессии белков (до 5% сухого веса растения) за счет репликации (амплификации) транскрибированной вирусной РНК и ее транспорта в соседние клетки с помощью транспортного белка (ТБ).

3. Начаты работы по изучению защитных механизмов растений, направленных на борьбу с генетическими стрессовыми факторами, в том числе с вирусной инфекцией – РНК-сайленсинга. Показано, что потивирусный белок HCpro и гордеивирусные gb-белки необходимы для системной вирусной инфекции, развития симптомов острой вирусной инфекции и подавления РНК-сайленсинга.

4. Продолжено изучение клостеровируса желтухи свеклы. С помощью моноклональных антител, полученных к фьюжн-белкам глютатион-S-трансферазы и папаин-подобной протеиназы (П-Про) вируса желтухи свеклы (ВЖС), методом электронной микроскопии (иммунное мечение золотом) вирусная папаин-подобная протеиназа локализвана в структурах, ранее идентифицированных как сайты репликативных белков в клетке.

5. Продолжалось исследование механизмов неспецифической агрегации молекул белка оболочки ВТМ под действием нагревания. Исследовано влияние различных факторов (концентрации белка, температуры, ионной силы среды и рН) на процесс агрегации. Предложена кинетическая модель процесса индуцированной нагреванием неспецифической (макроскопической) агрегации БО ВТМ. Согласно этой модели агрегация БО ВТМ представляет собой пример полимеризации, зависимой от нуклеации (образования ядра ассоциации), причем и стадия нуклеации, и стадия дальнейшего роста агрегатов являются необратимыми. Кроме того, из полученных данных следует, что в агрегацию вступают частично денатурированные молекулы БО, и число центров агрегации (ядер) остается неизменным в ходе процесса агрегации.

В отделе биохимии животной клетки предложена и доказана гипотеза, согласно которой мягкое окисление сульфгидрильных групп активного центра глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы приводит к появлению дополнительной ацилфосфатазной активности. Индукция ацилфосфатазной активности стимулирует гликолиз за счет разобщения стадий окисления и фосфорилирования. Установлена взаимосвязь влияния перекисных соединений на глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназу с вовлечением этого фермента в апоптоз. Доказано, что введение в мышечный экстракт нефосфорилирующей глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы вызывает ускорение гликолиза при низких концентрациях АДФ.

Наиболее значимыми научными результатами сотрудников отдела взаимодействия вируса с клеткойявляются следующие. Показано, что производные вакцинных штаммов полиовируса способны превращаться в циркулирующие и патогенные штаммы. Получены данные, свидетельствующие о том, что планируемое прекращение вакцинации против полиомиелита сопряжено с очень большим риском. Разработан новый метод массового и быстрого исследования РНК производных вакцинных штаммов полиовируса. В зараженных вирусом клетках выявлены повреждения ядерных пор, облегчающие двусторонний транспорт между ядром и цитоплазмой. Показано, что один из главных механизмов развития апоптоза в зараженной клетке – повреждение мембраны митохондрий. Получены новые неоспоримые доказательства нерепликативной рекомбинации между молекулами РНК.

В отделе изотопного анализа установлена нелинейная (U-образная) зависимость образования ДНК-белковых сшивок в лимфоцитах мышей при длительном низкоинтенсивном гамма-облучении животных, хорошо описываемая в рамках явления гормезиса (hormesis) – стимуляция при малых дозах, ингибирование при больших. Обнаружена временная зависимость гормезиса. Высказана гипотеза о возможном участии прочно-связанного гистона Н1 в компартментализации интерфазного хроматина в ядрах эукариотов. Установлены количественные изменения в соотношении гистона Н1 и ДНК в ходе органоптоза колеоптиля проростков пшеницы.

Наиболее значимые научные результаты, полученные в 2002 г. в отделе математических методов в биологии:

1. В группе клеточной биологии исследованы изменения цитоскелетных структур в ходе апоптоза, индуцированного фактором некроза опухолей (TNFa) в чувствительных к этому агенту трансформированных клетках матки человека HeLa. Показано, что индуцированный TNF апоптоз в клетках HeLa характеризуется ранним разрушением актинового цитоскелета, винкулин-содержащих фокальных контактов, сети кератиновых филаментов и микротрубочек.

2. В группе межклеточных взаимодействий (совместно с Йельским университетом (США) и Йоркским университетом (Канада)) исследованы механизмы регуляции роста в гифах мицелиального гриба Neurospora crassa. Совместно с Институтом канцерогенеза ОНЦ РАМН изучен механизм действия канцерогена и индуктора цитохрома P450 бензо(а)пирена на проницаемость межклеточных щелевых контактов. Показано, что индукция цитохрома P450 и нарушение функции щелевых контактов реализуются по различным механизмам.

3. В группе нейрофизиологии, используя антитела против нейротрансмиттеров, описана локализация нейронов, содержащих серотонин, дофамин и пептид, подобный Tritonia diomedea (TPep), в центральной нервной системе моллюсков Tritonia diomedea, Helix aspersa и Lymnaea stagnalis. Показано, что периферические ткани обильно иннервированы волокнами, содержащими эти нейротрансмиттеры.

4. В группе математики и медицинской диагностики предложена приближенная формула восстановления функции в задачах типа опто-акустической томографии; развита клейновская топологическая теория поля, обобщающая классические двумерные топологические теории поля; созданы и включены в пререлиз банка ProSite профили 15 семейств белковых доменов; совместно с Институтом биоорганической химии РАН создана доступная через Интернет бета-версия банка ретроэлементов в геноме человека.

В отделе молекулярных основ онтогенеза выполнено исследование метилирования ДНК и запрограммированной клеточной гибели (апоптоз) у растений, что принципиально важно для расшифровки фундаментальных механизмов клеточной дифференцировки, роста и развития растений и для создания новых эффективных способов повышения продуктивности важных сельскохозяйственных культур.

Отделом фотосинтеза и флуоресцентных методов исследований продолжена работа по обоснованию водно-поляронного механизма захвата энергии фотосинтетическими реакционными центрами пурпурных бактерий. Проведен анализ экстремальных формул. Продолжены работы по созданию теории делокализованных экситонов в фотосинтезе. Описана динамика сверхбыстрых оптических изменений и экситон-колебательной релаксации в светособирающем прицентровом комплексе LH1. Проведено моделирование спектров оптического поглощения и кругового дихроизма комплексов LH2 и LH3 из Rhodopseudomonas acidophila и Rhodospirillum molishianum на основе рентгеноструктурных данных, а также комплекса LH, содержащего Zn-бактериофеофитин. Создана специализированная программа «ExInAnt» для расчета спектров оптического поглощения и кругового дихроизма (на основе рентгеноструктурных данных). Создана программа «DerSpec» для разложения спектров на полосы стандартной формы (гауссовой) на основе исходного спектра и набора его неискаженных производных.

В отделе химии и биохимии нуклеопротеидов проведены исследования по дальнейшему выяснению молекулярных механизмов инициации трансляции у млекопитающих методом реконструкции инициирующих комплексов in vitro. Из индивидуальных компонентов удалось собрать инициирующие комплексы на мРНК бета-актина и поздних мРНК аденовирусов. Обнаружено явление транслокации ядерного белка протимозина альфа на внешнюю мембрану человеческих клеток при апоптозе.

Обнаружена ферментативная активность, аналогичная человеческой каспазе-3, в листьях табака после индукции гиперчувствительного ответа. Разработано несколько схем аналитического выделения необычной фосфодиэстеразы асцитной карциномы Кребс 2 мышей, катализирующей гидролиз ковалентной связи между белком ВПг и РНК пикорнавирусов. Впервые получены изображения вирусных РНК (на примере РНК ВТМ и РНК вируса ЭМК) и комплексов РНК с белками с помощью сканирующей зондовой микроскопии. Совместно с кафедрой вирусологии биологического факультета МГУ разработана технология молекулярной диагностики вироидной инфекции картофеля.

В отделе химии нуклеиновых кислот осуществлена аффинная модификация ДНК-метилтрансфераз EcoRII и SsoII, фермента репарации формамидопиримидин-ДНК гликозилазы E.coli и фактора транскрипции Nf–kB с помощью ДНК-реагентов, содержащих химически активные группы. Предложены новые типы активированных ДНК-лигандов с межнуклеотидной дисульфидной группировкой для тестирования остатков цистеина в активном центре белков, узнающих ДНК. Разработаны методики эффективного синтеза новых производных олигонуклеотидов, содержащих альдегидную группу в 2’-положении углеводного фрагмента. Отработаны способы присоединения к модифицированным олигонуклеотидам пептидов, обеспечивающих проникновение в клетку, подобраны методы выделения полученных олигонуклеотидопептидных конъюгатов. Открыты и охарактеризованы необычные структурные формы, образуемые гомопуриновыми последовательностями ДНК (одноцепочечные спирали, параллельные дуплексы, тетраплексы), представляющие большой интерес как возможные посредники в регуляции биологических процессов. Методом олигонуклеотид-направляемого мутагенеза получена серия сигма-субъединиц РНК-полимеразы E.coli, содержащих аминокислотные замены, изучение которых позволит расширить представления о механизме инициации транскрипции – одного из ключевых процессов жизнедеятельности клетки.

Отделом хроматографического анализа продолжено изучение in situ структурной организации растительных вирусов методом тритиевой планиграфии: изучена природа структурных изменений белка оболочки мутанта вируса табачной мозаики, определяющих характер инфекционного процесса; проведено изучение сайтов гликозилирования белка оболочки различных штаммов вируса Х картофеля, одного из наиболее распространенных представителей группы потексвирусов, поражающих растения картофеля. В плане развития метода тритиевой планиграфии к исследованию строения in situ мембранных белков были начаты работы по выделению и характеристике С-концевого фрагмента малой цепи гемагглютинина вируса гриппа А, содержащего трансмембранный сегмент. Отработана методика получения субвирусных частиц со срезанными бромелаином поверхностными гликопротеинами. Проведен анализ липидной фракции субвирусных частиц с целью идентификации высокогидрофобного и ацилированного пальмитиновыми кислотами фрагмента белка. Продолжено исследование структуры и функций динамичных, тонких и длинных тубуловезикулярных псевдоподий, формирующихся при адгезии нейтрофилов к белкам экстраклеточного матрикса. Предполагается, что тубуловезикулярные псевдоподии являются выпячиваниями тубуловезикулярных структур внутриклеточного транспорта и служат в качестве клеточных сенсорных и адгезивных органелл.

Отделом эволюционной биохимии по результатам секвенирования спейсерных участков ITS 2-4 хлоропластной-рДНК построены филогенетические деревья моховидных (Bryophyta). Показано, что моховидные являются разнородной парафилетической группой, древнейшими наземными растениями являются печеночники; антоцеротовые появились на более поздних стадиях эволюции, и они близки к сосудистым растениям. Проблематичный род Takakia оказывается в базальном положении на филогенетичесеом дереве листостебельных мхов. Наличие специфической вставки у Takakia в ITS3 хлоропластной рДНК противоречит включению Takakia как в андреевые, так и в сфагновые мхи.

По результатам секвенирования ITS 1–2 яДНК у 40 эндемичных для Китая и Непала видов зонтичных проведен филогенетический анализ, позволивший установить систематическое положение этих проблематичных эндемичных видов. Уточнены взаимоотношения основных родов подсемейств Apioideae и Saniculoideae. Подтверждена парафилетичность п\с Hydrocotyloideae. Ряд родов явно ближе к Araliaceae, а некоторые роды –к Apioideae. Azorella является сестринским родом по отношению к большому кластеру, объединяющему все Saniculoideae и Apioideae и более удаленным относительно клады Hydrocotyle–Araliaceae. Dickinsia очень далека от морфологически сходного Hydrocotyle и находится в большом кластере Apioideae.

Анализ ITS 1–2 яДНК видов Apioideae из Китая и Гималайской области Непала позволил провести критический анализ существовавших ранее филогенетических гипотез. Сделан вывод, что исторически сложившееся отнесение многих видов Китая и Гималайской области к традиционным крупным европейским родам Apioideae не оправдано. Наши данные показали, что виды из Китая и Гималайской области Непала образуют кластеры c видами Apioideae из того же ареала распространения. Вероятно, более оправданно выделение таких редких видов в самостоятельные мелкие роды, не имеющие прямого эволюционного родства и этими крупными европейскими родами.

Отделом сигнальных систем клетки установлена роль каждого Са2+-связывающего домена рековерина в механизме его Са2+-миристоильного переключателя. Впервые в сетчатке глаза обнаружен Са2+-связывающий белок аннексин IV. С помощью поликлональных (моноспецифических) антител против аннексина IV показано, что этот белок локализован во внешних и внутренних сегментах фоторецепторных клеток. Завершен серийный анализ образцов сыворотки крови пациентов с различными раковыми заболеваниями (мелкоклеточный рак легких, немелкоклеточный рак легких и целый ряд других видов рака) на присутствие аутоантител против рековерина и определены частоты встречаемости аутоантител при различных видах рака.